有一些网友想知道关于宏基因组分析与诊断技术概述和宏基因组学的题，本文都有详细的讲解，希望都能帮助到大家。
近年来，引起人类感染性疾病的病原微生物日益复杂多样，并且由于抗菌药物的过度使用而导致细菌耐药性增加，病原微生物引起了全世界的关注。感染是危重症患者死亡的主要原因之一，由于新病原微生物的出现、耐药病原微生物的增多以及免疫抑制宿主的增加，感染性疾病的发病率和死亡率居高不下。据世界卫生组织统计，传染病造成的死亡占全死亡人数的25%以上，每年约有1300万儿童死于传染病。在我国，感染性疾病占所有疾病的50%以上，75%的造血系统肿患者和50%的实体患者死于感染，脓症患者的死亡率达到50%。重症感染起病急、病情进展快、病原菌复杂，因此对于重症感染患者来说，能否快速识别感染病原是后续对症治疗的关键。题。
宏基因组测序的技术优势
传统的微生物鉴定方法分为培养和非培养两大类。临床上公认的“金标准”是分离、培养和生化鉴定。这种方法操作周期长，失败率高，而且并不是所有的病原体都能培养。不依赖培养的方法，如涂片镜检、抗体抗原免疫等，在标本采集当天即可出结果，这些方法虽然省时，但在灵敏度和特异性方面存在明显劣势。包括这些方法无法快速识别未知或罕见的病原微生物。mNGS不依赖传统的微生物培养，不需要特异性扩增，可以直接对临床样本中的核酸进行无歧视和选择性的高通量测序，并且可以与已知的微生物序列数据库进行比较分析。利用该技术可以确定样本中所含病原微生物的类型，从而可以快速、客观地检测临床样本中的病原微生物。
在急性、严重感染的情况下，患者常因遗传病、肿、营养不良、器官移植、药物等因素而出现免疫缺陷。除了常见感染外，您还特别容易受到机会性感染，例如它是由机会病原体引起的。参与这些类型感染的微生物类型复杂，难以根据经验预测，并且现有检测方法无法涵盖。另一方面，mNGS理论上可以报告基因组序列已知的所有病原体，目前包括8000多种病原体，其中包括3000多种细菌、4000多种病、200多种真菌和140种病。mNGS除了病原菌覆盖范围广、准确率高外，还可以获取耐药突变信息和力基因，高覆盖率的mNGS可以评估病原菌的药物敏感性，准确指导临床药物治疗。
由于上述优点，mNGS逐渐开始被认可，一些临床医生已经尝试使用它，相关临床指南和专家共识中也提到了mNGS。《中国利什曼原虫感染诊治专家共识》指出“文献中有报道，利用二代测序等方法，成功诊断出骨髓穿刺和活检无法检出的病例，并对‘儿童’呼吸道感染微生物检测标本进行采集、运输和检测。《建议》指出“全基因组测序是对传染病病原体的大规模核酸分析。我们可以提供这个。它拥有丰富的信息，在发现未知病原体方面具有无可比拟的优势。在《分子生物学》的《关于儿科呼吸道感染微生物检测样本的采集、运输和检测的建议》中，“第二代测序技术展示了以下优势虽然它们的通量很高，但它们在新发现方面带来了突破”病原体；这需要时间，因为二代测序结果还需要验证，不能直接用于临床诊断，而且成本相对较高，所以没有广泛使用。”《终末期肝病及合并感染诊治专家共识》指出我国成人医院“二代测序方法可从组织、拭子、抽吸物中提取DNA进行筛查分析鉴定”。《获得性肺炎和呼吸机相关性肺炎诊治指南》指出，“基于测序技术的临床宏基因组学通过分析致病菌的DNA或RNA含量和丰度来确定病原菌。临床样本中的微生物极大地提高了病原检测的灵敏度，缩短了检测时间，具有诊断罕见病原菌感染的优势，对于现有成熟检测技术无法识别的病原或患者可谨慎使用。虽然它针对的是对适当、规范的抗感染治疗没有反应的患者，但检测结果必须综合结合流行病学和临床特征，综合评估细菌是否致病。应用包括样本中的人类基因组干扰、生物信息学分析以及结果判断和解释。特别是当呼吸道本身未无菌且存在大量定植细菌核酸时，会出现困难。2019年，发布《紧急和严重感染宏基因组分析和诊断技术应用专家共识》。
从已发布的临床指南和专家共识来看，虽然mNGS已经开始在临床指南和专家共识中提及和推荐，但对于目前的结果验证、测试成本、开发条件等仍保持相对谨慎的态度。你给了我一个不成熟的暗示。mNGS是基于二代测序成本快速降低的新兴领域，虽然在体外诊断试剂开发中具有优势，但也存在诸多技术和监管难点。
临床应用的技术难点
需要建立标准化操作流程
mNGS需要对各类临床样本进行预处理，操作步骤包括但不限于上机前的核酸提取、文库制备、纯化、定量、质量控制等。还需要测序反应和数据分析。该过程复杂、费时、自动化程度低。大多数文库制备方法包括PCR扩增步骤，可能导致气溶胶污染，在实际临床采样、运输、处理和上机测序过程中，样本可能会受到环境、容器和试剂中微生物核酸的污染。因此，实验室必须在污染预防和质量控制方面建立一套标准化的操作程序。
高灵敏度是一把双刃剑
mNGS可覆盖8000多种病原体，检测灵敏度高，是一把双刃剑。由于环境、容器、试剂以及人体内含有的菌落微生物受到微生物核酸污染，mNGS结果中含有许多非病原微生物，而实际的病原体则隐藏在菌落和背景微生物中。因此，如何结合标本类型、实验对照和临床信息来准确鉴定病原菌是必须克服的难题。对于mNGS检测报告，检测机构应尽可能提供检测清单，临床医生应根据检测结果和临床病史做出判断。
胞内细菌/厚壁菌检出率低
由于细胞内传染性细菌释放到体液中的量较少，检测灵敏度较低，而且对于细胞壁较厚的病原微生物，核酸提取效率较低，导致临床检出率和灵敏度较低。因此，即使检测报告中检测到的特定胞内细菌/厚壁菌序列数量不高，也应考虑其为致病病原体的可能性。mNGS信息量大，很难在检测报告中列出所有检测到的病原体，对于罕见病原体、胞内细菌等，检测到的碱基序列数量较少，可能无法在检测报告中列出。测试报告。如果存在疑似微生物丰度较低的特定病原体的临床感染，则可以跟踪和查询原始数据。
RNA检测困难
一些病的基因组是RNA，因此无法使用DNA文库构建方法进行检测。同时，RNA的丰度与基因转录活性呈正相关，检测RNA可以识别死细菌和活细菌，并区分当前和过去的感染。因此，同时对DNA和RNA进行测序与单独进行DNA测序相比有很多优势，但人类RNA比DNA具有更高的丰度和复杂性，并且很容易被降解，导致样本运输和储存方面出现题。有更高的要求。如何可靠有效地实现DNA和RNA的同时检测，是提高mNGS临床检出率和准确性的保障之一。
平衡敏感性和经济成本是一个难题。
最终的测序数据由微生物序列和人类基因组序列组成。不同类型的人体样本，单位体积的细胞数量存在较大差异。人体细胞的数量、病原微生物感染的类型和病原微生物的数量各不相同。感染都会对测序产生影响，因为数据中目标微生物序列的比例、人体内背景细胞的数量较多以及感染后许多病原体的含量较低，导致目标病原体在数据中出现的数量有限。信息太少可能会丢失。增加数据量和增加检测深度是解决这个题最简单的方法，但也会导致检测成本的大幅增加。这将是mNGS面临的最大挑战。
目前还不可能完全诱导使用耐药菌。
目前，利用mNGS进行耐药检测还存在一定的困难，一是迄今为止报道的耐药基因型与耐药表型的相关性还存在一定差距，二是mNGS的使用。检测临床样本中的耐药性需要极高的测序深度来分析药物相关基因，这使得成本增加数千倍。因此，目前的mNGS不能完全指导针对耐药菌的抗感染药物的选择。
清晰的应用场景是关键。
微生物实验室目前已经拥有成熟的微生物鉴定检测流程，而mNGS这种新的检测方法或许可以在现有的微生物检测流程中找到合适的切入点。如何科学设计产品、合理选择目标人群、及时进行检测？作为一项实验室新兴技术，找到合适的应用场景是mNGS产业化的关键。
监督审查重点
由于mNGS是一项优势明显的技术，向产业化转型是必然趋势，相关医疗器械的监管过程中，特别是体外诊断试剂的审评过程中应考虑以下几个方面。
1标准化临床适用人群和临床适应症。根据目前的临床经验、研究成果以及mNGS技术的优势，mNGS临床应用的目标人群应主要是急性、重症感染患者，主要适应症如下危重症需要尽早识别病原菌。尽可能。对于免疫抑制剂、有基础疾病的患者、反复住院的严重感染患者等特殊患者，必须尽快查明病原菌。新病原体具有一定程度疑似传染性且临床怀疑的病例疑似特殊病原体感染的病例长期发热和/或其他临床症状以及不明原因感染的病例
2审查应根据患者负担和受益比重点关注产品的临床意义。
3mNGS可以早期发现病原体，指导抗菌药物的准确选择，减少抗菌药物的使用，降低患者死亡率，但这仍需要通过大规模研究证实，因此应根据mNGS的目的选择使用。产品设计在临床试验阶段进行验证，并针对相关人群使用足够的样本量进行验证。同时，mNGS产品临床适用人群的特异性和稀有性可能导致难以招募足够数量的人群，这可能会给临床试验审查带来挑战。
4.对于感染严重、生命体征不稳定的患者，通过mNGS识别致病菌后，可以针对病原进行精准治疗，治疗后密切跟踪患者的临床症状和治疗效果，并收集数据。必须可用。
5.应系统开发病原特征数据库和算法，算法审查应与数据库相结合，作为审查的核心部分。我们不能简单地假设公共数据库中可用的微生物数据越多越好。
目前，由于mNGS的转化仍然困难，韩国还没有体外诊断产品的应用。
一、宏基因组测序分析原理？
宏基因组测序是基于高通量测序技术研究微生物群落结构和功能的分析方法。分析原理如下
1-样本采集和处理首先，从研究对象中采集样本，然后提取总DNA并分离成小片段。
2-过程DNA测序利用高通量测序技术对小DNA片段进行测序，产生大量的短序列数据。
3-噪声去除和质量控制对测序数据进行噪声过滤和质量控制，以保持高质量的数据。
4-序列比对和注释将高质量的DNA序列与已知的基因组数据库进行比较，并进行功能注释，以确定该序列属于哪个微生物物种及其功能。
5-长度重组和基因预测相似序列的长度重组，去除冗余信息，基因预测。
6-功能分析和分类根据预测的遗传信息对样品中微生物的代谢、生长特征、群落结构进行分析和分类。
7-数据可视化和解释对分析的数据进行可视化和解释，以方便研究人员对数据的理解和进一步分析。
宏基因组研究是通过对环境样本中的DNA进行高通量测序来探索和研究微生物群落的遗传信息。
其基本思想是从环境样本中提取DNA，通过高通量测序技术获得大量DNA序列数据，然后利用生物信息学方法对这些数据进行分析和解释。
关键技术包括DNA提取、文库构建、高通量测序、序列分析和功能注释。这些技术的发展和应用为深入了解微生物群落的组成、功能和生态作用提供了重要的工具和方法。
二、什么是宏基因组组装的基因组？
它包含来自可培养和不可培养微生物的基因，目前主要指环境样本中细菌和真菌的完整基因组。宏基因组学或宏基因组学是对环境样本中微生物的研究。
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